Меню

Русский выбор страны
Статьи по темеТваринництво (загальне) → Сучасні аспекти кріоконсервації сперми бугаїв
Тваринництво (загальне)

Сучасні аспекти кріоконсервації сперми бугаїв

Кріоконсервація сперми бугаїв має широке практичне застосування завдяки наявності цілого ряду завершених технологій заморожування (9, 10, 17, 19, 21). Вони суттєво відрізняються за технологічними прийомами підготовки сперми до кріоконсервації, складом кріозахисних середовищ, технікою її заморожування, розморожування і використання.

Однак, незважаючи на те, що дане питання вже вивчене, головною проблемою залишається значне зниження біологічної повноцінності сперміїв в процесі кріообробки. Вже навіть на стадії охолодження виникають конформаційні зміни ліпопротеїдних комплексів біомембран, які в подальшому посилюються при кристалізації і деконсервації і проявляються появою трансмембранних дефектів (1, 7). Вони викликають порушення проникності мембран, цілого комплексу біохімічних змін, що призводить до зниження Племенной быкбіологічної повноцінності сперміїв і навіть їх загибель. При вивченні ультраструктури розморожених сперміїв за допомогою електронної мікроскопії, нами було виявлено, що лише 7,3% клітин не мають ознак порушень цитоплазматичної мембрани (ЦПМ); 33,7% мають незначні пошкодження, які проявляються набуханням та невеликим відшаруванням від акросоми, без зміни їх цілісності; 37% сперміїв мають середні порушення ЦПМ із збільшенням її товщини та ознаками зернистого розпаду, а для 22% характерні розрив цілісності ЦПМ і акросоми з виходом акросомального вмісту і навіть повною деструкцією клітин. За даними P.Watson i S.Martin (23), також лише 28% розморожених сперміїв мали цілісну акросому. При зберіганні розмороженої сперми в клітинах з пошкодженою акросомою відбувається втрата акросомального вмісту, зокрема ферментів, які беруть участь у процесі запліднення. Так, за даними наших досліджень, якщо в розмороженій спермі у звільненому стані знаходилось 27,2% гіалуронідази (до заморожування 22,7%), то через 4 години інкубації при 38°С вихід її із акросоми становив уже 56,9%. Таким чином, спермії після розморожування зберігають запліднювальну здатність протягом дуже короткого часу.

Однією із причин швидкого руйнування мембранних структур при зберіганні розморожених сперміїв є інтенсифікація ланцюгових перекисних процесів їх ліпідів, ініційованих заморожуванням, накопичення агресивних вільних радикалів, які в свою чергу призводять до порушення проникності мембран та втрати каталітичних властивостей ферментів (1, 8). Біологічна повноцінність розморожених сперміїв залежить від наявності в системі антиоксидантів, які здатні гасити ці перекисні процеси, зв’язувати вільні радикали. З цією метою до складу кріоконсервантів пропонували вводити антиоксиданти - токофероли, убіхінон, іонол, унітіол, цистеїн, ехінохром та інші (3, 4, 6, 8, 15, 22). Нами були запропоновані спеціальне СГГЖЕ-середовище для заморожування сперми бугаїв (12) та універсальна стабілізуюча добавка до кріоконсервантів „ГСС“ (11). Основою „ГСС“ є тканинний антиоксидант глутатіон редукований, що міститься в надвисоких концентраціях. Її використання при консервації сперми бугаїв підвищує виживаність сперміїв у 2 і навіть у 4 рази, а запліднювальну здатність на 10-17,5%. „ГСС“ може застосовуватись як ефективна стабілізуюча добавка до середовищ заморожування сперми різних видів тварин при будь - яких технологіях кріоконсервації, а також в коригуючих середовищах для кріоконсервації сперми з низькою морозостійкістю.

СГГЖЕ-середовище створене на основі препарату, одержаного нами з ехінацеї пурпурової (Echinacea purpurea Moench),багаторічної рослини з родини астрових. Ми встановили його позитивну дію на клітини з пониженою енергетикою. Він виявився ефективним біостимулятором ослаблених сперміїв, підвищуючи їх енергію, рухливість та швидкість до фізіологічної норми. Крім того, препарат з ехінацеї стабілізував життєздатність як для ослаблених, так і нормальних сперміїв, подовжуючи їх виживаність у 1,5-2 рази порівняно з контролем. На основі одержаних експериментальних даних вважаємо, що основним механізмом дії цього препарату на клітинному рівні є його антиоксидантний захист. Адже за літературними даними препарати з ехінацеї містять унікальний набір антиоксидантів - поліненасичені жирні кислоти, селен, поліфенольні сполуки з структурою, подібною аскорбіновій кислоті, які мають пряму антирадикальну дію, компоненти які вміщують тіол та інші [16]. Крім того, до їх складу входять і різноманітні полісахариди. Саме полісахаридний комплекс має особливе значення для сперміїв: стабілізує рецепторний апарат їх акросоми і сприяє реакції ооцит-спермій при заплідненні. Таким чином, препарати можуть компенсувати втрачені при розрідженні властивості нативної сперми, необхідні для запліднення яйцеклітини.

Хранение спермыНайефективнішим кріозахисне СГГЖЕ-середовище виявилось при заморожуванні сперми бугаїв з пониженою морозостійкістю. Порівняно з аналогами, його використання підвищує після розморожування: рухливість сперміїв - на 27%, виживаність при 38˚С - на 75-100%, швидкість руху сперміїв - на 11,8%, енергію - на 40,5%, запліднювальну здатність - на 15%.

Враховуючи специфічний вплив препарату з ехінацеї пурпурової на рецепторний апарат акросоми сперміїв, нами був розроблений спосіб заморожування сперми бугаїв з високими ступенями розбавлення без зниження її запліднювальної здатності. Відомо, що при заморожуванні спермодоз з низькою концентрацією (5-7 млн.) рухливих сперміїв за загальноприйнятою технологією відбувається значне зниження їх якості. Так, за нашими даними, показники виживаності розморожених сперміїв в цьому випадку зменшувались у 2-3 рази, хоч їх рухливість інколи залишалась на рівні контролю. А при осіменінні телиць спермою з різною концентрацією рухливих сперміїв в спермодозі (від 15 до 3,5 млн.) ми одержали також послідовне зниження запліднювальної здатності цих спермодоз (від 87,5% до 33,3% відповідно).

В технології кріоконсервації сперми бугаїв з високими ступенями розбавлення закладено використання дворазового розрідження сперми за спеціальною схемою: спочатку додатковим середовищем - для створення сталих умов сперміям, потім СГГЖЕ-середовищем, як основним кріоконсервантом. Виробнича перевірка показала, що застосування нових технологічних елементів кріоконсервації дає змогу заморожувати спермодози з низькою концентрацією (5-7 млн.) рухливих сперміїв без зниження їх якості, а за показниками виживаності перевищувати контроль (15 млн.) більш ніж на 50%. Запліднювальна здатність такої сперми також не мала статистично значущої різниці і становила 64,1% порівняно з 58,1% у контролі. Використання цього способу кріоконсервації збільшувало вихід замороженої спермопродукції більш ніж у 2 рази при збереженні її високої запліднювальної здатності, що є особливо важливим для високоцінних у генетичному відношенні племінних бугаїв- поліпшувачів породних і продуктивних якостей нащадків.

Широке використання спермодоз з низькою концентрацією сперміїв в практиці штучного осіменіння неможливе без введення нового методу контролю якості замороженої спермопродукції, що гарантувало б одержання високої заплідненості самок. В основі цього контролю повинна бути оцінка якості сперми за показником „запліднювальна здатність сперміїв“. Тобто, сертифікат якості на заморожену спермопродукцію повинен включати основний критерій - „запліднювальна здатність сперміїв“ з її диференційованою оцінкою.

Запліднювальна здатність сперміїв, як інтегральний багатофакторний показник, обумовлена комплексом рухових факторів клітин, станом їх мембранного апарату, рівнем обмінних процесів. При кріоконсервації сперми в мембранних структурах сперміїв часто з’являються „приховані пошкодження“ (20), які проявляються лише через деякий час після розморожування. Запліднювальна здатність такої сперми буде незначна, хоч показники якості сперми, оцінені відразу після розморожування як біологічними, так і морфологічними чи біохімічними методами, можуть залишатись високими. Тому більшість авторів пропонують для визначення запліднювальної здатності використовувати лише комплексні тести (5, 18, 20).

Розроблений нами спосіб оцінки запліднювальної здатності сперміїв (14) базується на визначенні енергетичних показників сперми, а саме: початкової і середньої енергії сперміїв. Енергія сперміїв - це комплексний руховий показник сперми, що характеризує здатність сперміїв забезпечити їх доставку до яйцеклітини і чисельно залежить від маси рухливих клітин та швидкості їх руху. Початкова енергія визначається відразу після розморожування. Середня енергія - це показник зміни енергії сперміїв за перші 2 години їх життєдіяльності в оптимальних умовах. Вона залежить не лише від рухових факторів, але і від рівня обмінних процесів клітин, обумовлених станом їх мембранних структур. Енергетичні показники розмороженої сперми мають високі коефіцієнти кореляції із запліднюваністю телиць після осіменіння цією спермою: r=+0,75±0,125. За даними енергетичних показників якість розмороженої сперми розділяють на 4 градації: низька - з запліднювальною здатністю сперміїв менше 55%, понижена - 55-65%, середня - 65-75% і висока - понад 75%.

Енергетичні показники сперми визначаються на розробленому нами лазерному аналізаторі якості сперми (ЛАОКС) (13), робота якого базується на використанні методу кореляційної доплерівської спектрометрії. ЛАОКС складається із джерела монохроматичного випромінювання, термостатованого оптичного блоку і ІВМ-сумісного комп’ютера з периферичним обладнанням. Принцип дії приладу
базується на реєстрації розсіяного на рухомих сперміях лазерного випромінювання, яке має доплерівський зсув за частотою. Підготовлений зразок сперми поміщають в кювету з робочою довжиною 1 мм і ставлять в термостатовану камеру аналізатора для прогрівання та адаптації сперміїв до лазерного випромінювання і проводять запуск робочої програми для вимірювання. В програмі задані умови - 5 виборок по 10000 вимірювань кожна. В кінці вимірювання на екрані чи в роздрукованому вигляді представлені результати вимірювання за такими показниками: рухливість сперміїв (бал.), швидкість їх руху (мкм/сек.), енергія (од.), а також похибка вимірювань у відсотках, коефіцієнт варіабільності та статистична значимість одержаних результатів з урахуванням похибок апаратури та біологічних шумів досліджуваної біологічної системи.

Для визначення запліднювальної здатності сперміїв відразу після розморожування сперми на ЛАОКСі визначають початкову енергію сперміїв (Ео). Одночасно з вимірюванням другий зразок цієї ж сперми поміщають у водяний термостат при t°=38°С на 2 години. Після цього проводять повторне вимірювання енергії сперміїв, аналогічне попередньому (Е2). На основі одержаних даних обчислюють середню енергію сперміїв за формулою:, де Еc - середня енергія сперміїв, умовних одиниць; Е0 - початкова енергія сперміїв, умовних одиниць; Е2 - енергія сперміїв через 2 години, умовних одиниць.

Виробничу перевірку способу оцінки запліднювальної здатності сперміїв за їх енергетичними показниками проводили на 30 серіях кріоконсервованої сперми різної якості шляхом осіменіння 1560 телиць в господарствах Київської і Полтавської областей. Перевірка підтвердила високу достовірність (Р>0,99) критерію відповідності (χ2=2,76) теоретичної запліднювальної здатності сперміїв, розрахованої за їх енергетичними показниками, фактичній заплідненості телиць від першого осіменіння цією спермою.

Лазерний аналізатор якості сперми може бути використаний не лише для визначення теоретичної запліднювальної здатності сперміїв, але і для експрес-прогнозування кріорезистентності нативної сперми. При розробці цієї методики була використана здатність сперміїв змінювати свої швидкісні характеристики під впливом зміни осмотично активних речовин навколишнього середовища. Тест осмотичної стійкості швидкості сперміїв (ОСТш) оцінюється за зниженням швидкості руху сперміїв під дією гіпертонічного розчину цитрату натрію, порівняно з розчином, близьким до ізотонічного. Цей метод оцінки нативної сперми увійшов до нового Державного стандарту України на нативну сперму (2). Експрес - прогнозування кріорезистентності нативної сперми дозволяє використати спосіб диференційованої кріоконсервації сперми.

Дослідженнями встановлено, що замороження еякулятів з рухливістю сперміїв понад 6 балів, швидкістю вище 65 мкм/с, енергією понад 35 од, незалежно від кріорезистентності, дає заморожену спермопродукцію, що відповідає ГОСТу 26030 - 83, тобто може використовуватись для штучного осіменіння самок. Еякуляти, що мали якість нижче зазначених величин, при заморожуванні давали результати залежно від їх кріорезистентності. Вони позитивно корелювали з показником ОСТш.

Суть диференційованого способу заморожування сперми бугаїв полягає в тому, що еякуляти з рухливістю понад 6 балів, швидкістю понад 65 мкм/с, енергією понад 35 од. заморожуються без обмежень у загальноприйнятих кріоконсервантах, а еякулянти з показниками нижче зазначених величин, але з показниками кріорезистентності ОСТш вище 40 одиниць потребують додаткового використання спеціального коригуючого середовища. Для їх корекції кріоконсервацію проводять з використанням СГГЖЕ-середовища чи універсальної стабілізуючої добавки "ГСС". Після розморожування така сперма, на відміну від контролю, має високьної якісні показники, запліднювальну здатність - вище 65 %. Еякуляти з показником морозостійкості ОСТ менше 40 одиниць вибраковуються. Таким чином, використання диференційованого підходу до кріоконсервації сперми бугаїв на основі експрес-прогнозування з послідуючою корекцією її кріорезистентності, значно підвищить ефективість методу глибокого заморожування.

    1. БІБЛІОГРАФІЯ
  • Белоус А.Н., Бондаренко В.А., Гулевский А.К. Молекулярно-клеточная концепция криоповреждения клетки: роль трансмембранных дефектов // Криобиология. - 1987. - № 2. - С.3 - 10.
  • ДСТУ 3535 - 97 // Сперма бугаїв нативна. Технічні умови.
  • Милованов В.К., Кольцова Е., Шайдуллин И.Н., и др. Химическая природа антиоксидантов и их действие при замораживании семени барана // Животноводство. - 1981. № 9. - С.45 - 46.
  • Милованов В.К., Кононов В.Н., Азизова О.А. и др. Физические свойства мембранных липидов и устойчивость живчиков при глубоком охлаждении // Вестник с.-х. наук. - 1984. - № 2. - С.93 - 100.
  • Мороз Л.Г. Теоретические аспекты низкотемпературной консервации спермы сельскохозяйственных животных. // Криоконсервация спермы сельскохозяйственных животных. - 1988. - С.7 - 56.
  • Назарин В., Григорин С. Действие антиоксидантов на сперму барана при глубоком ее замораживании // Животноводство. - 1981. - № 9. - С.19 - 50.
  • Наук В.А. Структура и функция спермиев сельскохозяйственных животных при криоконсервации // Кишинев. - „Штиинца“. - 1991. - 197 с.
  • Наук В.А., Гуськов А.М. Особенности перекисного окисления липидов мембран при замораживании спермы быков и хряков- производителей // Доклады ВАСХНИЛ.- 1983 № 2. - С.27 - 29.
  • Осташко Ф.И., Павленко М.П., Кузнецов Г.Н. Харьковская технология криоконсервации спермы животных // Теор. и прикл. аспекты биотехнол. - К., - 1991. - С.32 - 33.
  • Пакенас П.Й. Байсогальская технология криоконсервирования семени быков // Животноводство. - 1985. - № 1. - С.16 - 18.
  • Патент СССР №1797740 // Стабилизирующая добавка к средам для замораживания спермы животных. - Приоритет от 01.03.91.
  • Патент України №10894 // Середовище для розбавлення і заморожування сперми бугаїв. - Публ. 29.12.99. - Бюл. № 8.
  • Патент України №13369 // Спосіб оцінки якості сперми. - Публ. 28.02.97. - Бюл. №1.
  • Рішення Держпатенту України № 99127230 // Спосіб оцінки запліднювальної здатності сперми. - Пріоритет від 29.12.99.
  • Рустенов А.Р., Мороз Л.Г., Шапиев И.Ш. Влияние серосодержащих соединений на устойчивость спермы быков к замораживанию // Бюл. ВНИИ развед. и генет. с.-х. животных. - 1989. - № 116. - С.7 - 10.
  • Самородов В.Н., Поспелов С.В., Моисеева Г.Ф. и др. Фитохимический состав представителей рода эхинацея (Echinacea Moench) и его фармакологические свойства (обзор) //Хим.-фарм. журн. - 1996. - Т. 30. - № 4. - С. 32 - 37.
  • Ющенко Н.П. Замораживание спермы животных в гранулах жидким азотом // Воспроизводство и искусственное осеменение с.-х. животных. - ВАСХНИЛ, Всес. НПО по плем. делу в животноводстве. - 1990. - С.31- 38.
  • Brett J.H., Cox N.M., Stevenson J.S. Advances on Reproduction in Dairy Cattle // J.оf Dairy Science. - 1981. - v.64. - № 6. - Р.1378- 1402.
  • Cassou R. La methode des paillettes en plastique adapt la generalization de la congelation // C.R. Acad. Agric. - 1964. - № 50. - Р.881- 887.
  • Saacke R.G. Semen quality in relation to semen preservation // J.of Dairy Science - 1983.- 66. - № 12. - Р.2635- 2644.
  • Simmit L. A fully automatic method of packaning bull semmen in plastic tubes according to the Landshut method // VII - th International Congress Animal Reproduction. - Munchen. - 1972. - v. 11. - Р.1357.
  • Slaweta R. Wplyw dodatku glutationu do konserwacii nasienia buhajow // Przeglad hodowlany. - 1988. - № 21. - p.15- 16.
  • Watson P., Martin S. A comparison of changes in the acrosomes of deep frozen in plastic strows // J. of Animal Science. - 1975. - 40. - № 2. - Р.302- 305.

Автор: Зубец М.В., академик УААН, Буркат В.П., академик УААН, Бегма А.А., кандидат сельскохозяйственных наук, Бегма Л.А., кандидат сельскохозяйственных наук



Рассказать об этой статье: 
Другие статьи в разделе: Тваринництво (загальне)
Застосування каркасно-тентових споруд для утримання ВРХ - Будівництво швидкомонтованих каркасно-тентових корівників один з найбільш оптимальних варіантів. Сучасні технології будівництва корівників, недорогі фундаментні підстави, короткий термін будівництва, низька матеріалом...
Кормова добавка з ехінацеєю пурпуровою для підвищення спермопродуктивності биків - Враховуючи унікальний фотохімічний склад ехінацеії пурпурової (Echinacea purpurea Moench), яка містить комплекс біологічно активних речовин (поліфеноли, полісахариди, фітостероли, ненасичені жирні кислоти,...
Методи покращення якості яловичини - Найважливішими факторами, які впливають на м’ясну продуктивність і якість м’яса — це, безумовно, є порода, рівень годівлі, спосіб вирощування, вік та стать. Зараз у розвитку скотарства нашої країни відмічено ...
Порівняння якості м'яса бичків різних напрямів продуктивності - Проблема підвищення ефективності м’ясного скотарства пов’язана з потребою збільшення кількості порід, які в змозі відповісти на стан годівлі інтенсивним ростом м’язової тканини протягом тривалого пер...
Племінне розведення червоної степової худоби - При застосуванні спорідненого розведення для поліпшення молочної худоби не менш важливим є визначення якості батьків, а також типу спарювання, при якому вони одержані. Інбредність батька і матері або їх...
Сучасні аспекти кріоконсервації сперми бугаїв - Кріоконсервація сперми бугаїв має широке практичне застосування завдяки наявності цілого ряду завершених технологій заморожування (9, 10, 17, 19, 21). Вони суттєво відрізняються за технологічними прийомами підготовки ...
Вплив вермітана і L-аргініну на імунобіологічні показники крові корів при фасціолезно-дікроцеліозной інвазії - Серед найбільш поширених гельмінтозів великої рогатої худоби лісостепової зони України (Полтавська і Сумська області) є фасціольоз та дикроцеліоз. Вданий час для боротьби з ними використовується велик...
Вплив сукцинату натрію на репродуктивну функцію кнурів-плідників - Науковими та практичними дослідженнями доведена доцільність використання різних специфічних і неспецифічних біологічно-активних препаратів та інших речовин з метою підвищення загальної резистентності орг...
Корекція обміну мікроелементів при фасциолезе і дикроцеліоз корів - Патогенний вплив фасціол і дикроцелій на організм тварин супроводжується крім механічної, токсичної, трофічної та інокуляторної дії явищами імуносупресії, тобто розвитком другорядних імунодефіцитів, обумов...
Фотогалереи
биопро
зерно